Реплікація і репарація ДНК

Реплікація (від лат. replicatio — відтворення) — це самоподвоєння молекули ДНК, тобто синтез дочірніх молекул ДНК на материнській молекулі як на матриці. Це одна з трьох реакцій матричного синтезу в клітині, поряд із транскрипцією (синтезом РНК на матриці ДНК) і трансляцією (синтезом білка на матриці РНК). Без реплікації жодна клітина не змогла б передати спадкову інформацію нащадкам.

Коли відбувається реплікація

В еукаріотів реплікація ДНК відбувається в S-періоді (синтетичному) інтерфази — тобто перед поділом клітини. Інтерфаза складається з трьох періодів: G₁ (пресинтетичний), S (синтетичний) і G₂ (постсинтетичний). Саме в S-періоді подвоюється вся ДНК ядра. Після цього клітина входить у мітоз або мейоз, де вже подвоєні хромосоми розходяться в дочірні клітини. Реплікація відбувається лише один раз за клітинний цикл — це гарантує, що кожна дочірня клітина отримає точну копію генетичного матеріалу.

Де відбувається реплікація

В еукаріотів основна реплікація відбувається в ядрі клітини. Крім того, власну ДНК реплікують мітохондрії та пластиди (хлоропласти в рослин) — ці органели мають власні кільцеві молекули ДНК і власний апарат реплікації. У прокаріотів (бактерій) реплікується кільцева ДНК нуклеоїду, а також плазміди.

Що відбувається з хромосомами після реплікації

Після завершення реплікації кожна хромосома складається з двох сестринських хроматид — двох однакових молекул ДНК, з'єднаних центромерою. Важливо: кількість хромосом не змінюється, подвоюється лише кількість молекул ДНК. Наприклад, у людини в клітині перед S-періодом 46 хромосом і 46 молекул ДНК (набір 2n2c), а після S-періоду — 46 хромосом, але 92 молекули ДНК (набір 2n4c). Саме тому в профазі мітозу хромосоми вже подвоєні — реплікація відбулася заздалегідь, в інтерфазі.

Чому реплікація починається в багатьох точках

Молекули ДНК еукаріотів дуже довгі — загальна довжина ДНК в одній клітині людини сягає приблизно 2 метри. Якби реплікація починалася лише в одній точці, як у бактерій, подвоєння тривало б надто довго (тижнями). Тому в еукаріотів реплікація починається в багатьох точках кожної хромосоми — так званих ori-сайтах (точках початку реплікації). Утворюються численні реплікаційні бульбашки, які зливаються, коли реплікаційні вилки зустрічаються. Не всі ori-сайти активуються одночасно — деякі запускаються раніше, інші пізніше, що дозволяє клітині контролювати швидкість подвоєння. У бактерій реплікація починається в одній точці кільцевої ДНК і триває в обидва боки.

Реплікація — це складний ферментативний процес, у якому беруть участь понад десяток різних білків. Розгляньмо головні з них — хеліказу, праймазу, ДНК-полімеразу й ДНК-лігазу.

Хеліказа: розплітання подвійної спіралі

Першим на сцену виходить фермент хеліказа. Він із витратою енергії АТФ розплітає подвійну спіраль ДНК, розриваючи водневі зв'язки між комплементарними основами. У результаті утворюється структура, яку називають реплікаційною вилкою, — ділянка, де два материнські ланцюги розходяться й стають матрицями для синтезу нових ланцюгів. Окремі білки (SSB-білки, від англ. single-strand binding) зв'язуються з розплетеними ланцюгами й не дають їм знову з'єднатися.

ДНК-полімераза: добудова нового ланцюга

Головний будівельник — фермент ДНК-полімераза. Він приєднує до нового ланцюга нуклеотиди, комплементарні нуклеотидам матриці: навпроти аденіну (А) ставить тимін (Т), навпроти гуаніну (Г) — цитозин (Ц), і навпаки. ДНК-полімераза нарощує ланцюг лише в напрямку 5′ → 3′. Проте почати ланцюг «з нуля» вона не може — їй потрібна коротка РНК-затравка (праймер) завдовжки приблизно 10–15 нуклеотидів, яку синтезує інший фермент — праймаза.

Чому один ланцюг синтезується фрагментами

Ланцюги ДНК антипаралельні: один має напрямок 5′ → 3′, другий — 3′ → 5′. ДНК-полімераза може рухатися лише в напрямку 5′ → 3′, тому на одному материнському ланцюзі синтез нового ланцюга відбувається безперервно в напрямку руху реплікаційної вилки — це лідирувальний (провідний) ланцюг. На другому материнському ланцюзі синтез доводиться вести в протилежному напрямку, тому новий ланцюг утворюється короткими фрагментами, які називають фрагментами Оказакі (на честь японських учених Рейдзі та Цунеко Оказакі). Кожен такий фрагмент починається з РНК-затравки. Згодом затравки видаляються, прогалини заповнюються ДНК-полімеразою, а ДНК-лігаза зшиває всі фрагменти в єдиний безперервний ланцюг.

Енергія та точність реплікації

Енергію для приєднання кожного нуклеотиду дають самі нуклеозидтрифосфати (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ). Як і АТФ, вони мають макроергічні зв'язки, розрив яких забезпечує енергію для утворення фосфодіестерного зв'язку між нуклеотидами. Крім того, ДНК-полімераза має здатність перевіряти кожен приєднаний нуклеотид і, якщо він некомплементарний, вирізати його (коректорська активність 3′ → 5′). Завдяки цьому помилки реплікації трапляються вкрай рідко — приблизно одна помилка на $10^9$ нуклеотидів.

Як саме розподіляються материнські ланцюги між дочірніми молекулами? Відповідь дає напівконсервативний принцип реплікації.

Напівконсервативний принцип

Кожна дочірня молекула ДНК складається з одного материнського (старого) і одного новосинтезованого ланцюга. Тобто материнські ланцюги не знищуються, а розходяться в різні дочірні молекули, і на кожному з них добудовується новий комплементарний ланцюг. Такий механізм передбачили Джеймс Вотсон і Френсіс Крік одразу після відкриття структури ДНК у 1953 році, а експериментально довели Метью Мезельсон і Франклін Сталь у 1958 році.

Дослід Мезельсона — Сталя

Мезельсон і Сталь вирощували кишкову паличку (Escherichia coli) на середовищі, що містило важкий ізотоп Нітрогену ${}^{15}$N. Усі азотисті основи ДНК бактерій увібрали ${}^{15}$N, тому молекули ДНК стали важчими. Потім бактерій перенесли на середовище з легким ізотопом ${}^{14}$N і дали їм поділитися. Після першого поділу всю ДНК центрифугували в градієнті густини хлориду цезію — виявилося, що вся ДНК має проміжну густину (гібридні молекули ${}^{15}$N/${}^{14}$N). Після другого поділу половина молекул ДНК мала проміжну густину, а половина — легку (${}^{14}$N/${}^{14}$N). Це відповідало напівконсервативній моделі й спростувало дві альтернативні гіпотези: консервативну (материнська молекула залишається цілою, а нова синтезується з нуля) і дисперсну (материнські й нові фрагменти чергуються в усіх молекулах).

Вправа на комплементарність

На НМТ можуть трапитися вправи на комплементарність (у демоваріанті 2026 — завдання № 3), наприклад добудувати новий ланцюг ДНК за материнським. Наприклад, материнський ланцюг має послідовність:

3′-Т-А-Ц-Г-Г-А-Т-5′

Новий ланцюг синтезується в напрямку 5′ → 3′, тому його послідовність буде:

5′-А-Т-Г-Ц-Ц-Т-А-3′

Зверни увагу: ця послідовність збігається з другим материнським ланцюгом (якби ми його знали). У ДНК немає урацилу (У) — лише аденін (А), тимін (Т), гуанін (Г) і цитозин (Ц). Якщо у варіанті відповіді бачиш урацил — це РНК, а не ДНК.

Кількісні вправи

Після n циклів реплікації з однієї молекули ДНК утворюється $2^n$ молекул. Материнських ланцюгів лише два, тому їх містять лише 2 молекули з $2^n$. Частка молекул, що містять старий ланцюг, дорівнює $2:2^n=1:2^{n-1}$, а частка старих ланцюгів серед усіх $2^{n+1}$ ланцюгів — $2:2^{n+1}=1:2^n$.

Приклад: після 3 циклів реплікації з однієї молекули утворюється $2^3=8$ молекул ДНК. З них 2 молекули — гібридні (містять один старий і один новий ланцюг), а 6 молекул — повністю нові (обидва ланцюги синтезовані в процесі реплікації).

ДНК — головна молекула клітини, пошкодження якої не замінюють, а виправляють: для неї існують численні системи репарації. Пошкодження ДНК трапляються постійно, і без системи репарації життя було б неможливим.

Що пошкоджує ДНК

ДНК щодня зазнає тисяч пошкоджень від різних чинників. Ультрафіолетове світло (сонячне) зшиває сусідні тиміни одного ланцюга, утворюючи тимінові димери — це найпоширеніше пошкодження від засмаги. Хімічні речовини (наприклад, компоненти тютюнового диму, деякі харчові консерванти) змінюють хімічну структуру основ. Іонізувальна радіація (рентгенівське та гамма-випромінювання) може розривати ланцюги ДНК. Крім того, навіть у звичайних умовах основи спонтанно втрачають аміногрупи (дезамінування) або відриваються від цукрофосфатного кістяка (апуринізація). І, звісно, трапляються помилки під час самої реплікації, хоча ДНК-полімераза виправляє більшість із них одразу.

Як працює репарація

Репарація (від лат. reparatio — відновлення) — це виправлення пошкоджень ДНК за допомогою спеціальних ферментів. Загальна схема така: спочатку ферменти-нуклеази розпізнають пошкоджену ділянку й вирізають її з одного ланцюга. Потім ДНК-полімераза добудовує цю ділянку, використовуючи неушкоджений комплементарний ланцюг як матрицю. Нарешті, ДНК-лігаза зшиває новосинтезовану ділянку з рештою ланцюга. Репарація можлива саме тому, що ДНК дволанцюгова: інформацію записано двічі — у ланцюзі та в комплементарній йому послідовності. Якщо один ланцюг пошкоджено, другий слугує зразком для відновлення.

Нобелівська премія за дослідження репарації

У 2015 році Нобелівську премію з хімії отримали Томас Ліндаль, Пол Модрич і Азіз Санджар за дослідження механізмів репарації ДНК. Ліндаль відкрив механізм ексцизійної репарації основ (BER), Санджар — ексцизійної репарації нуклеотидів (NER), а Модрич — репарації неспарених основ (mismatch repair).

Наслідки порушення репарації

Якщо пошкодження не виправлене до наступної реплікації, воно може закріпитися: ДНК-полімераза під час реплікації «прочитає» пошкоджену ділянку неправильно, і в новому ланцюзі з'явиться змінена послідовність нуклеотидів. Так виникає мутація. Типи мутацій і мутагени — окрема тема курсу «Мінливість, селекція і біотехнологія». Класичний приклад спадкового порушення репарації — пігментна ксеродерма (xeroderma pigmentosum). У людей із цим захворюванням пошкоджений один із ферментів репарації тимінових димерів. Їхня шкіра надзвичайно чутлива до ультрафіолету: навіть коротке перебування на сонці спричиняє сильні опіки, а згодом — множинні пухлини шкіри.

Розгляньмо типові завдання НМТ на тему реплікації та репарації. Усі вони мають формат вибору однієї відповіді з чотирьох.

Приклад 1. Молекули ДНК після кількох циклів реплікації

Молекулу ДНК, обидва ланцюги якої містять важкий ізотоп ${}^{15}$N, тричі реплікували в середовищі, що містить лише ${}^{14}$N. Скільки з утворених молекул ДНК містять хоча б один ланцюг із ${}^{15}$N?

Розв'язання. Після 3 циклів реплікації з однієї молекули утворюється $2^3=8$ молекул. Материнських ланцюгів лише два, і вони містять ${}^{15}$N. За напівконсервативним принципом ці два старі ланцюги розходяться в різні дочірні молекули. Отже, лише 2 молекули з 8 містять ${}^{15}$N (кожна — один старий і один новий ланцюг). Решта 6 молекул мають обидва ланцюги з ${}^{14}$N.

Відповідь: 2 молекули.

Чому інші варіанти неправильні: 1 — відповідає консервативній моделі (материнська молекула залишається цілою); 8 — дисперсній моделі (ізотоп нібито рівномірно розподілений по всіх молекулах); 4 — помилкове ділення навпіл ($8:2=4$), без урахування напівконсервативного принципу.

Приклад 2. Добудова ланцюга за комплементарністю

На ділянці материнського ланцюга ДНК із послідовністю 3′-Г-Ц-А-Т-Т-А-Ц-5′ синтезується новий ланцюг. Яка його послідовність?

Розв'язання. Новий ланцюг синтезується в напрямку 5′ → 3′. Під кожним нуклеотидом матриці пишемо комплементарний йому: Г (гуанін) парує з Ц (цитозин), Ц — з Г, А — з Т, Т — з А. Отримуємо: 5′-Ц-Г-Т-А-А-Т-Г-3′.

Відповідь: 5′-Ц-Г-Т-А-А-Т-Г-3′.

Чому інші варіанти неправильні: 5′-Ц-Г-У-А-А-У-Г-3′ — містить урацил (У), який є в РНК, а не в ДНК; 5′-Г-Ц-А-Т-Т-А-Ц-3′ — це копія матриці, а не комплементарний ланцюг; 5′-А-Т-Г-Ц-Ц-Г-Т-3′ — переплутано пари (А замість Ц, Т замість Г тощо).

Приклад 3. Судження про реплікацію

Марія сказала: «Після реплікації кожна хромосома складається з двох однакових хроматид». Андрій заперечив: «ДНК реплікується в профазі мітозу, коли хромосоми спіралізуються». Хто має рацію?

Розв'язання. Марія має рацію: після реплікації кожна хромосома дійсно складається з двох сестринських хроматид — двох ідентичних молекул ДНК, з'єднаних центромерою. Андрій помиляється: реплікація ДНК відбувається в S-періоді інтерфази, а не в профазі мітозу. У профазі хромосоми вже подвоєні, вони лише спіралізуються (стають видимими в мікроскоп).

Відповідь: лише Марія.

Приклад 4. Пігментна ксеродерма

У людей із пігментною ксеродермою під дією сонячного світла швидко виникають пухлини шкіри. Порушення якого процесу спричиняє цю хворобу?

Розв'язання. Пігментна ксеродерма — спадкове захворювання, спричинене порушенням репарації ДНК, а саме — нездатністю вирізати тимінові димери, які утворюються під дією ультрафіолету. Накопичення невиправлених пошкоджень веде до мутацій і раку шкіри.

Відповідь: репарації ДНК.

Чому інші варіанти неправильні: реплікація ДНК у S-періоді — у хворих вона не порушена; транскрипція — синтез РНК, не пов'язаний із пошкодженнями від ультрафіолету; сплайсинг — вирізання інтронів з пре-мРНК, теж не стосується репарації.

• Розміщують реплікацію в профазі мітозу, хоча вона відбувається в S-періоді інтерфази. У профазі хромосоми вже подвоєні — реплікація завершилася заздалегідь.

• Вважають, що одна дочірня молекула повністю стара, а друга повністю нова. Це консервативна модель, яку спростував дослід Мезельсона — Сталя. Насправді кожна дочірня молекула має один старий і один новий ланцюг.

• Ставлять урацил (У) у новий ланцюг ДНК, плутаючи реплікацію з транскрипцією. У ДНК завжди тимін (Т), а урацил — у РНК. Якщо бачиш у відповіді У — це РНК, а не ДНК.

• Вважають, що ДНК-полімераза нарощує ланцюг в обох напрямках, тому обидва нові ланцюги синтезуються безперервно. Насправді ДНК-полімераза працює лише в напрямку 5′ → 3′, тому відстаючий ланцюг синтезується фрагментами Оказакі.

• Вважають, що після реплікації кількість хромосом подвоюється. Насправді подвоюється лише кількість молекул ДНК (c), а кількість хромосом (n) залишається незмінною до моменту поділу.

• Вважають, що будь-яке пошкодження ДНК одразу стає мутацією, забуваючи про репарацію. Більшість пошкоджень виправляються ферментами репарації. Мутацією пошкодження стає лише тоді, коли воно не виправлене до наступної реплікації.

Тема «Реплікація і репарація ДНК» входить до теми 1.5 програми НМТ з біології. Програма вимагає вміти пояснювати напівконсервативний принцип реплікації та розв'язувати елементарні вправи з реплікації.

Форма завдань

Завдання з цієї теми можуть мати форму вибору однієї відповіді з чотирьох (А–Г, завдання 1–24, 0 або 1 бал); як додаткова тема 1.5 трапляється й у логічних парах (у демоваріанті 2026 — № 25). Завдань із розгорнутою відповіддю немає, тому результат будь-якої вправи потрібно знайти серед чотирьох запропонованих варіантів.

Що треба знати напам'ять

Довідкових матеріалів на НМТ немає. Пари комплементарних основ (А–Т, Г–Ц) треба знати напам'ять. Той самий прийом добудови ланцюга за комплементарністю демоваріант 2026 року перевіряє в завданні № 3 (тема 1.2 — нуклеїнові кислоти).

Стратегія виконання

• У завданні на добудову ланцюга ДНК пиши пару під кожним нуклеотидом матриці. Це допоможе не пропустити жодної позиції.

• Перевір, чи немає урацилу (У) у варіантах відповіді. Якщо є — це РНК, а не ДНК, і такий варіант майже напевно неправильний.

• Дистрактор може відрізнятися від ключа лише однією позицією. Уважно порівнюй усі чотири варіанти.

• У задачах на кількість молекул після реплікації пам'ятай: материнських ланцюгів завжди два, тому після будь-якої кількості циклів лише 2 молекули містять старий ланцюг.

• Реплікація — самоподвоєння ДНК у S-періоді інтерфази, перед поділом клітини.

• Хеліказа розплітає подвійну спіраль, ДНК-полімераза нарощує новий ланцюг за принципом комплементарності (А–Т, Г–Ц) лише в напрямку 5′ → 3′, а ДНК-лігаза зшиває фрагменти Оказакі.

• Кожна дочірня молекула ДНК складається з одного материнського й одного нового ланцюга (напівконсервативний принцип, доведений Мезельсоном і Сталем у 1958 році).

• Після n циклів реплікації з однієї молекули утворюється 2ⁿ молекул; материнські ланцюги містяться лише у двох із них.

• Після реплікації хромосома має дві сестринські хроматиди, але число хромосом не змінюється — подвоюється лише кількість ДНК.

• Репарація вирізає пошкоджену ділянку ДНК і добудовує її за неушкодженим комплементарним ланцюгом; порушення репарації веде до накопичення мутацій (приклад — пігментна ксеродерма).