Генна і клітинна інженерія, клонування організмів

Біотехнологія — це використання живих організмів, їхніх клітин і біологічних процесів для виробництва потрібних людині продуктів. Людство застосовує біотехнології з давніх часів, навіть не знаючи про існування мікроорганізмів: хлібопечення й виноробство неможливі без дріжджів, а кисломолочні продукти (йогурт, кефір, сир) — без молочнокислих бактерій.

Сучасна біотехнологія спирається на методи молекулярної генетики й клітинної біології. До них належать генна інженерія (перенесення генів між організмами), клітинна інженерія (вирощування клітин і тканин поза організмом, злиття клітин), полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і клонування ДНК. Ці методи дають змогу створювати організми з новими властивостями й отримувати речовини, які раніше були недоступні.

Мікробіологічний синтез

Мікробіологічний синтез — це промислове виробництво речовин за допомогою мікроорганізмів. Бактерії, гриби та дріжджі ростуть на дешевих живильних середовищах, швидко розмножуються й синтезують велику кількість потрібних продуктів. Їхні штами поліпшують методами селекції (мутагенез і добір) або генної інженерії.

Мікроорганізми — зручні продуценти, тому що швидко розмножуються, ростуть на дешевих середовищах (відходи сільського господарства, меляса), а їхній метаболізм легко спрямувати на синтез потрібної речовини. Важливо пам'ятати: не всякий мікробіологічний синтез є генною інженерією. Пеніцилін, стрептоміцин, лимонну кислоту отримують від штамів, поліпшених класичним мутагенезом і добором, без перенесення генів.

Генна інженерія — це сукупність методів виділення генів, їх перенесення з одного організму в інший і вбудовування в геном. Результатом є рекомбінантна ДНК — молекула, що поєднує фрагменти ДНК різного походження. Організм, який отримав чужорідний ген, називають трансгенним.

Інструменти генної інженерії

Для маніпуляцій із ДНК використовують спеціальні ферменти:

«Липкі» кінці — це одноланцюгові виступи на кінцях розрізаної ДНК, які комплементарні один одному. Вони полегшують з'єднання фрагментів, тому що можуть «злипатися» за принципом комплементарності, після чого лігаза остаточно зшиває ланцюги.

Вектори: плазміди й віруси

Вектор — це молекула ДНК, яка переносить цільовий фрагмент ДНК у клітину-хазяїна. Вектор для експресії гена містить не лише сайт для вставки чужорідної ДНК, а й регуляторні елементи: промотор, термінатор, сайт зв'язування рибосоми. Основні типи векторів:

• Плазміди — невеликі кільцеві молекули ДНК бактерій, які подвоюються незалежно від бактеріальної хромосоми. Їх легко виділити, модифікувати й ввести назад у бактерію. Плазміди містять маркерні гени (наприклад, стійкість до антибіотика) для відбору трансформованих клітин.

• Віруси — бактеріофаги (віруси бактерій) і ретровіруси (віруси тварин) також використовують як вектори, особливо для перенесення генів у клітини еукаріот.

Етапи створення рекомбінантного білка (на прикладі інсуліну)

Інсулін людини — гормон, що регулює рівень глюкози в крові. До появи генної інженерії його отримували з підшлункових залоз свиней і корів, що було дорого й викликало алергію. 1978 року вперше синтезували людський інсулін у бактеріях, а з 1982 року його почали застосовувати як ліки.

1. Отримують кДНК інсуліну: з клітин підшлункової залози людини виділяють зрілу мРНК інсуліну й за допомогою зворотної транскриптази синтезують комплементарну ДНК (кДНК) без інтронів.

2. Підготовляють плазміду для експресії: плазміду розрізають рестриктазою, отримуючи липкі кінці, сумісні з кінцями кДНК.

3. З'єднують кДНК і плазміду: ДНК-лігаза зшиває фрагменти, утворюючи рекомбінантну плазміду.

4. Вводять рекомбінантну плазміду в бактерію (трансформація) й відбирають клони, які отримали плазміду (за маркером стійкості до антибіотика).

5. Вирощують відібрані бактерії у ферментері, індукують експресію гена інсуліну, очищають синтезований білок.

Спільність генетичного коду — необхідна умова для синтезу людського білка бактерією, але сама по собі не забезпечує експресію цілого гена людини. Гени людини містять інтрони, яких бактерії не можуть вирізати, тому потрібна кДНК без інтронів, а також бактеріальні регуляторні ділянки.

Якщо потрібно отримати багато копій самого гена (а не білка), застосовують клонування ДНК — вставку фрагмента в плазміду, розмноження в бактеріях і виділення. Цей метод детальніше розглядають в окремому уроці «ПЛР, клонування ДНК і ГМО».

Клітинна інженерія — це методи вирощування клітин і тканин поза організмом на штучних живильних середовищах і конструювання клітин нового типу. На відміну від генної інженерії, яка маніпулює окремими генами, клітинна інженерія працює з цілими клітинами.

Культура клітин і тканин

Клітини рослин і тварин здатні розмножуватися в пробірці на живильних середовищах, що містять поживні речовини, вітаміни, гормони. Такі культури мають широке застосування:

• Отримання біологічно активних речовин: наприклад, женьшень вирощують у культурі клітин, щоб добувати його лікувальні сполуки без знищення рідкісних рослин.

• Тестування ліків: на культурах клітин перевіряють токсичність та ефективність нових препаратів.

• Вирощування вірусів для вакцин: віруси розмножуються тільки в живих клітинах, тому культури клітин використовують як середовище для нарощування вірусної маси.

Гібридизація соматичних клітин

Гібридизація соматичних клітин — це злиття двох клітин (або їхніх протопластів) з утворенням гібридної клітини, яка поєднує генетичний матеріал обох батьківських клітин.

• У рослин спершу ферментативно знімають клітинну стінку й отримують протопласти. Протопласти різних видів (наприклад, картоплі й томата) можна злити, і з гібридної клітини регенерувати цілу рослину — соматичний гібрид.

• У тварин клітинної стінки немає, тому злиття проводять безпосередньо. Особливе значення має гібридома — гібрид B-лімфоцита (продуцента антитіл) і мієломної клітини (ракової клітини, здатної до безмежного поділу). Гібридома синтезує моноклональні антитіла — ідентичні антитіла до одного антигену, які використовують у діагностиці, лікуванні та наукових дослідженнях.

Клональне мікророзмноження рослин

Клональне мікророзмноження — отримання великої кількості генетично ідентичних рослин з невеликих фрагментів тканин (експлантів) на живильному середовищі з фітогормонами. Експланти беруть із меристем (верхівкових або бічних), листків, стебел тощо. Залежно від співвідношення ауксинів і цитокінінів, експлант може розвиватися прямо в пагін і коріння або спочатку утворювати калус — недиференційовану масу клітин, з якої потім регенерують рослини.

Меристемна культура має особливе значення для оздоровлення рослин. Верхівкові меристеми часто вільні від вірусів, тому вирощування рослин із меристем на живильному середовищі в поєднанні з контролем інфекцій дає змогу отримувати безвірусний садивний матеріал — наприклад, безвірусну картоплю. Однак не всі культури автоматично безвірусні чи цілком незмінні генетично: в культурі можуть виникати сомаклональні варіації (мутації).

Клон — це група генетично ідентичних нащадків однієї особини. У природі клони поширені: рослини, що розмножуються вегетативно (живцями, вусами, бульбами), дають клони; однояйцеві (монозиготні) близнюки в людини — теж природні клони, оскільки розвиваються з однієї зиготи, що розділилася.

Клонування тварин: перенесення ядра соматичної клітини

Метод клонування тварин полягає в перенесенні ядра соматичної клітини в яйцеклітину, з якої попередньо видалили власне ядро. Першими пересадили ядро в енуклейовану яйцеклітину жаби Р. Бріггс і Т. Кінг (1952). Джон Гердон 1962 року показав, що навіть ядро диференційованої клітини кишечника пуголовка забезпечує розвиток нормального пуголовка, а згодом — і дорослої жаби.

Найвідоміший приклад — вівця Доллі, народжена 1996 року в Шотландії (група Яна Вілмута). Етапи:

1. Взяли ядро з клітини молочної залози дорослої вівці (донор ядра, біла вівця).

2. Виділили яйцеклітину іншої вівці й видалили з неї власне ядро (донор цитоплазми, шотландська чорноморда вівця).

3. Перенесли ядро соматичної клітини в енуклейовану яйцеклітину.

4. Стимулювали клітину до поділу, зародок розвивався in vitro.

5. Зародок імплантували третій вівці (сурогатна мати, теж шотландська чорноморда вівця), яка виносила й народила Доллі.

Доллі генетично ідентична (за ядерною ДНК) донору ядра — білій вівці, а не сурогатній матері чи донору яйцеклітини. Мітохондріальна ДНК Доллі походить переважно від яйцеклітини (чорномордої вівці), оскільки мітохондрії передаються через цитоплазму.

Наслідки клонування

• Переваги: можна розмножувати цінних тварин (рекордні молочні корови, коні-чемпіони), відновлювати рідкісні й вимерлі види.

• Ризики: ефективність клонування дуже низька — Доллі була однією з 277 спроб; підвищений ризик втрати ембріонів, порушень розвитку, передчасного старіння; генетична однорідність клонів робить їх однаково вразливими до хвороб.

• Репродуктивне клонування людини в Україні заборонено законом.

Химерні організми

Химерний організм (химера) складається з клітин різних генотипів, що походять від різних зигот. Химеру створюють поєднанням ранніх зародків (або їхніх клітин) двох різних ліній. Наприклад, якщо з'єднати зародки мишей білої й чорної ліній на стадії 8 клітин, розвинеться плямиста миша — одні ділянки її тіла будуть білими, інші чорними. Отримано також химеру вівці та кози.

Розгляньмо типові завдання НМТ з теми «Генна і клітинна інженерія, клонування організмів». Кожен приклад супроводжується покроковим розв'язанням і поясненням помилок.

Приклад 1. Логічні пари: інструмент → функція

Установіть відповідність між інструментом генної інженерії (1–4) і його функцією (А–Д).

Розв'язання: рестриктаза (1) розрізає ДНК — А; ДНК-лігаза (2) зшиває — Б; плазміда (3) — це кільцева ДНК-вектор — В; зворотна транскриптаза (4) синтезує ДНК на матриці мРНК — Г. Варіант Д («доставляє амінокислоти до рибосоми») описує транспортну РНК (тРНК), яка не є інструментом генної інженерії.

Приклад 2. Вибір однієї відповіді: клонування вівці

Ядро клітини шкіри білої вівці перенесли в яйцеклітину без ядра чорної вівці. Зародок виносила сіра вівця. Якій вівці ягня генетично ідентичне за ядерною ДНК?

• А білій вівці (донору ядра)

• Б чорній вівці (донору яйцеклітини)

• В сірій вівці (сурогатній матері)

• Г це гібрид білої й чорної вівці

Розв'язання: ядерна ДНК клону походить виключно з ядра, яке перенесли. Ядро взяли від білої вівці, тому ягня генетично ідентичне білій вівці (А). Чорна вівця дала цитоплазму з мітохондріями, але не ядерну ДНК. Сіра вівця лише виносила зародок і не передала йому своєї ДНК. Варіант Г неправильний, бо гібрид утворюється злиттям гамет, а тут ядро перенесли в яйцеклітину без ядра — запліднення не відбулося.

Приклад 3. Вибір однієї відповіді: метод клітинної інженерії

Укажіть метод, який належить до клітинної інженерії.

• А вбудовування гена інсуліну в плазміду

• Б отримання безвірусної картоплі з верхівкової меристеми на живильному середовищі

• В схрещування редьки з капустою

• Г опромінення насіння для отримання мутантів

Розв'язання: клітинна інженерія працює з цілими клітинами й тканинами. Варіант Б — клональне мікророзмноження з меристеми, типовий метод клітинної інженерії. Варіант А — генна інженерія (перенесення гена). Варіант В — віддалена гібридизація (схрещування), метод селекції, а не клітинної інженерії. Варіант Г — штучний мутагенез (опромінення насіння), метод селекції рослин, а не клітинної інженерії.

Приклад 4. Два судження учнів: химера чи гібрид

Марко: «Химера, як і гібрид, розвивається з однієї зиготи.» Олена: «У химери є клітини з різними генотипами.» Хто має рацію?

• А лише Марко

• Б лише Олена

• В обоє мають рацію

• Г обоє помиляються

Розв'язання: Марко помиляється — химера розвивається з клітин двох (або більше) різних зигот, а гібрид — з однієї зиготи, утвореної злиттям гамет. Олена має рацію: у химері співіснують клітини з різними генотипами. Отже, правильна відповідь — Б (лише Олена).

• Плутають генну інженерію (перенесення генів) з клітинною (маніпуляції з цілими клітинами). Запам'ятай: об'єкт генної інженерії — ДНК і гени; об'єкт клітинної інженерії — клітини й тканини.

• Вважають, що ядерний генотип клону походить від сурогатної матері чи донора яйцеклітини. Насправді ядерну ДНК дає донор ядра, а мітохондріальну — переважно яйцеклітина (через цитоплазму).

• Плутають химеру (клітини двох генотипів існують поруч в одному організмі) і гібрид (кожна клітина містить гени обох батьків, бо походить від однієї зиготи).

• Плутають функції ферментів: вважають, що рестриктаза зшиває, а лігаза розрізає ДНК. Запам'ятай: рестриктаза — «ножиці», лігаза — «клей».

• Думають, що в бактерію вводять готовий білок інсуліну. Насправді в бактерію вводять ген інсуліну, і бактерія сама синтезує білок за цим геном.

• Вважають будь-який мікробіологічний синтез генною інженерією. Пеніцилін, стрептоміцин, лимонну кислоту отримують від штамів, поліпшених мутагенезом і добором, без перенесення генів.

Тема «Генна і клітинна інженерія, клонування організмів» належить до теми 2.4 «Селекція організмів. Біотехнологія» (розділ 2 програми НМТ з біології): «Методи молекулярної генетики як основа біотехнологій (генна інженерія, клітинна інженерія), клонування організмів». Від тебе вимагають знати химерні організми й прогнозувати наслідки сучасних біотехнологій.

У демоваріанті НМТ-2026 окремого завдання з теми 2.4 немає, але зміст тесту визначає вся програма (характеристика НМТ-2026). Тому завдання з цієї теми можуть з'явитися в будь-якому варіанті.

Форми завдань:

• Вибір однієї відповіді з чотирьох (завдання 1–24, 0 або 1 бал). Сюди входять і завдання формату «два судження учнів» (як № 4 і 16 демоваріанта).

• Логічні пари (завдання 25–28, 1–4 → А–Д, до 4 балів). Можливі пари, наприклад: «інструмент → функція», «метод → приклад».

Стратегія виконання: визнач об'єкт маніпуляцій — ген (генна інженерія), клітина (клітинна інженерія), ядро й зародок (клонування, химери). Довідкових матеріалів на НМТ немає. На 30 завдань відведено орієнтовно 60 хвилин, тож на кожне завдання маєш близько 2 хвилин.

• Біотехнологія використовує живі організми, їхні клітини й біологічні процеси для виробництва продуктів. Мікроорганізми синтезують антибіотики (пеніцилін, стрептоміцин), амінокислоти (лізин), вітаміни (B₁₂), ферменти, кормовий білок, лимонну кислоту.

• Генна інженерія маніпулює генами: рестриктаза розрізає ДНК у певних послідовностях, ДНК-лігаза зшиває фрагменти, вектор (плазміда, вірус) переносить ген у клітину.

• Рекомбінантний інсулін людини отримують у бактеріях: кДНК без інтронів вбудовують у плазміду для експресії, трансформують бактерії, відбирають клони й вирощують для синтезу білка (1978, ліки з 1982).

• Клітинна інженерія працює з цілими клітинами: культура клітин і тканин, злиття соматичних клітин (протопласти рослин, гібридома для моноклональних антитіл), клональне мікророзмноження рослин (безвірусна картопля з меристем).

• Клонування тварин — перенесення ядра соматичної клітини в яйцеклітину без ядра. Ядерна ДНК клону походить від донора ядра, мітохондріальна — переважно від яйцеклітини. Вівця Доллі (1996) — ядро від білої вівці, яйцеклітина від чорномордої, виносила інша чорноморда вівця.

• Химера — клітини різних зигот в одному організмі; гібрид — одна зигота від злиття гамет, кожна клітина має гени обох батьків.